Laboratoř molekulární a nádorové virologie
Vedoucí:
doc. RNDr. Ruth Tachezy, Ph.D.
Katedra genetiky a mikrobiologie
Vedoucí
BIOCEV Vestec, 2NP, místnost A2.016
Viničná 5, 2NP, místnost 117A
Kde nás najdete:
Areál BIOCEV, Průmyslová 595, Vestec u Prahy, 252 42
1. nadzemní podlaží, křídlo 3 (místnosti 004, 007, 015, 016)
Výzkumná problematika
Laboratoř molekulární a nádorové virologie byla založena v roce 2015 skupinou pracovníků, kteří přestoupili z Ústavu hematologie a krevní transfuze v Praze a zapojili se jako výzkumný tým "Identifikace cílů pro diagnostiku a terapii nádorových onemocnění asociovaných s lidskými viry" do programu Buněčná biologie a virologie v tehdy nově vzniklém výzkumném centru BIOCEV ve Vestci. Laboratoř nadále úzce spolupracuje s NRL pro papilomaviry a polyomaviry, která původně byla součástí ÚHKT a dnes sídlí ve Zdravotním ústavu se sídlem v Ostravě. V našich projektech úzce spolupracujeme i s Laboratoří imunoterapie a Laboratoří virologie katedry genetiky a mikrobiologie PřF UK v Praze. V r. 2024 jsme se v rámci programů "Interakce mezi patogeny a hostiteli" a "Imunita proti virům a bakteriím" stali součástí i Národního institutu virologie a bakteriologie, což je platforma sdružující špičková vědecká pracoviště z celé ČR.
Naše Laboratoř se dlouhodobě zabývá molekulární epidemiologií papilomavirů, polyomavirů a studiem nově objevených malých DNA virů. Pro zjištění virové etiologie u onemocnění využíváme jak metody přímého průkazu virového agens, tak metody nepřímé – sérologické a imunohistochemické. Zabýváme se i surveilance některých virových onemocnění především v souvislosti s plošným zaváděním či modifikací preventivních screeningových a vakcinačních programů. Některá onemocnění asociovaná s virovou infekcí využíváme jako modelové systémy pro hledání diagnostických a terapeutických cílů.
Práce Laboratoře zahrnuje i výzkum zvířecích papilomavirů. V minulosti jsme se podíleli na identifikaci řady nových zvířecích papilomavirů a tuto expertizu používáme dále při diagnostice infekcí u zvířat klinicky se manifestujících jako onemocnění spojovaná s papilomaviry – papilomy, fibromy, fibropapilomy, sarkomy.
Projektem surveilance lidských papilomavirů (HPV) se Laboratoř zabývala v souvislosti se zavedením organizovaného screeningového programu pro karcinom děložního hrdla, který je téměř ve 100 % asociovaný s infekcí vysoce rizikovými (HR) typy HPV a v souvislosti se zavedením plošné vakcinace proti HPV. V české populaci jsme analyzovali typově-specifickou prevalenci HPV infekcí v premaligních a maligních onemocněních asociovaných s HPV, analyzovali jsme typově-specifickou prevalenci ve screeningové populaci českých žen a dále seroprevalenci HPV-specifických protilátek ve zdravé populaci ČR i u pacientů. Při studiu prevalence HPV infekcí ve vakcinované populaci žen ČR jsme u mladých žen nalezli vysokou prevalenci širokého spektra HPV typů. Mezi těmito ženami v naší populaci je 11 % těch, které jsou incidentně a/nebo perzistentně infikovány HR vakcinačními typy HPV a lze u nich předpokládat sníženou účinnost vakcín. HPV specifické protilátky měla jen polovina žen, z čehož je zřejmé, že vakcinace proti HPV bude velmi přínosná i u žen, které již pohlavně žijí.
Ve spolupráci s Medical Healthcom (hlasové a sluchové centrum Praha) jsme provedli studii efektu vakcinace proti HPV u pacientů s benigním onemocněním laryngu – rekurentní laryngeální papilomatózou (RLP), které je vyvoláno nízkorizikovými (LR) typy HPV, především typem 6. Přestože se jedná o benigní onemocnění, vyznačuje se značnou morbiditou a potenciální možností maligní konverze. Současné možnosti léčby jsou omezené. Nadějí pro pacienty z hlediska zlepšení kvality života by mohlo být očkování tetravalentní HPV vakcínou, která obsahuje i antigeny HPV6 a 11. V našich předešlých studiích jsme ukázali, že pacienti s RLP často nemají protilátky proti typům HPV, které ji vyvolávají. Tyto protilátky se objevují až po několika chirurgických zásazích pro odstranění papilomů. Aplikace vakcíny by měla stimulovat robustní protilátkovou odpověď a navodit přítomnost neutralizačních protilátek na povrchu sliznice horních cest dýchacích, což by zpomalilo/inhibovalo růst HPV-asociovaných lézí. Naše klinické hodnocení fáze III.b sledovalo efekt vakcinace tetravalentní vakcínou na frekvenci rekurencí pacientů s RLP.
Tým Laboratoře se dále intenzivně zabýval vztahem HPV a karcinomů vulvy, karcinomu anální oblasti, karcinomu močového měchýře a prostaty. V současnosti spolupracujeme na projektu optimalizace diagnosticko-terapeutického managementu kondylomat, prekanceróz a karcinomů vulvy s Gynekologicko-porodnickou klinikou a Ústavem patologie a molekulární medicíny 2. LF UK a FN Motol. Vedle znaků virové infekce zjišťujeme vztah exprese proteinů p16, p53 a SOX2 k typu léze a přítomnosti HPV.
Od roku 2001 provádíme ve spolupráci s Klinikou otorinolaryngologie a chirurgie hlavy a krku 1. LF UK a FN Motol studii etiologie HPV infekce u pacientů s nádory hlavy a krku. V rámci této studie jsme ukázali, že především nádory orofaryngu jsou až v 69% asociované s aktivní infekcí HR HPV. V dalších studiích jsme též popsali rizikové faktory pacientů s HPV-asociovanými a neasociovanými nádory. Ukázali jsme, že tradiční prognostické markery u pacientů s HPV-asociovanými nádory, dosud klinicky využívané, nebudou mít u těchto pacientů stejnou výpovědní hodnotu. Vzhledem k tomu, že pacienti s HPV-asociovanými nádory vykazují lepší odpověď na léčbu a lepší přežití, vyvstala otázka diagnostiky virové infekce v klinické praxi a možnosti modifikace léčby těchto pacientů. Naše studie hodnotila vztah virové etiologie nádorů orofaryngu k úspěšnosti jednotlivých léčebných modalit. Výsledky ukazují na možnosti modifikace léčebných postupů u pacientů s HPV-asociovaným tumorem a budou základem pro odborná doporučení léčby těchto pacientů v ČR. Z hlediska diagnostiky HPV-asociovaných nádorů jsme prokázali nutnost kombinace dvou metod, detekce HPV DNA metodou PCR a detekce exprese proteinu p16, pro jednoznačný průkaz virové etiologie těchto nádorů. Výsledkem našich studií bude doporučení kombinace metod a jejich posloupnosti pro klinickou praxi.
V nejnovějších výzkumných projektech se zabýváme studiem expresních miRNA profilů u nádorů hlavy a krku (HNC), ve vztahu k etiologii onemocnění a prognóze, s cílem vybrat takové miRNA, které by mohly být léčebnými a diagnostickými znaky pro specifickou skupinu HNC. Na rozdíl od karcinomů děložního hrdla, které jsou téměř vždy spojené s infekcí HPV, HPV pozitivní a negativní HNC představují jedinečný model pro studium rakoviny, která je způsobena odlišnými molekulárními mechanismy – mechanismem souvisejícím s virem a mechanismem na viru nezávislém. Porovnávali jsme expresní profily miRNA nádorů tonsil detailně charakterizovaných co do etiologie a dále statutu HPV genomu v nádoru. Expresní profily jsme porovnávali s nádory hrdla děložního a s expresními profily modelového systému lidských keratinocytů imortalizovaných HPV nebo lidským telomerázovým genem. Identifikovali jsme tzv. „HPV core“ miRNA specifické pro nádory etiologicky spjaté s HPV infekcí a dále miRNAs specifické pro HPV-asociované tonsilární nádory a nádory tonsil s nevirovou etiologií. V dalších analýzách budeme ověřovat přítomnost HPV core miRNA v dalších HPV-asociovaných nádorech různé anatomické lokalizace a provádět funkční testy na selektovaných miRNA.
Další projekt, kterým se zabýváme, je zaměřený na objasnění mechanismu kancerogeneze v nádorech asociovaných s HPV infekcí, kde však virus není přítomný v integrované, ale extrachromosomální formě. Provádíme metylační a sekvenační analýzy regulační oblasti virového genomu, zejména vazebných míst pro časný virový protein E2, který funguje jako transkripční regulační faktor pro přepis virových onkoproteinů E6 a E7.
Dalším zaměřením výzkumného týmu je imunoprofilování imunitních buněk periferní krve a imunitních buněk infiltrujících HNC. Charakterizace imunitní odpovědi je pro řadu karcinomů důležitým prognostickým nástrojem, který je potenciálně ještě důležitější než současný systém klasifikace nádorových onemocnění. Výsledky studií by mohly pomoci identifikovat nové cíle pro léčebné strategie, a to včetně imunoterapie rakoviny a též zlepšit chápání patofyziologie virem indukovaných nádorů. Naše pilotní výsledky ukázaly, že nižší poměr CD8+/ CD4+ CD25+ T buněk v periferní krvi pozitivně ovlivňuje celkové přežití a to nezávisle na HPV statutu. Pacienti s HPV-asociovanými nádory mají vyšší počet CD8+ T buněk. V nádorové tkáni měli pacienti s nádory virové etiologie vyšší počet IFN-γ CD8+ lymfocytů, IL-17+ CD8+ lymfocytů, myeloidních dendritických buněk a prozánětlivých cytokinů. HPV-pozitivní nádory měly nižší expresi Cox-2 mRNA a vyšší expresi PD1 mRNA. V současné době ve spolupráci s týmem Laboratoře imunoterapie a s Klinikou dětské hematologie a onkologie 2. LF UK a FN Motol spolupracujeme na zavedení metody detekce, kvantifikace a fenotypizace imunitních buněk v periferní krvi a nádorech na průtokovém hmotnostním spektrometru CyTOF. Pro detekci, kvantifikaci a fenotypizaci buněk ve fixované tkáni (tzv. tissue cytometry or in situ cytometry) jsme získali unikátní multimodální a multispektrální přístroj Mantra (PerkinElmer).
Kromě klinických materiálů/nativní tkáně se v současné době začínáme zaměřovat také na studium HPV životního cyklu, včetně infekčnosti, přenosu a schopnosti viru interagovat s hostitelskými buňkami a strukturami in vitro. Vzhledem k tomu, že životní cyklus HPV je pevně spojen s diferenciací hostitelské buňky, je velmi těžké produkovat virus v buněčné kultuře. Proto byly vytvořeny systémy, pro produkci rekombinantních papilomavirových částic, jako jsou viru podobné částice (virus-like particles VLP), které vznikají infekcí hmyzích buněk rekombinantními baculoviry, nesoucími geny pro kapsidové proteiny příslušných virů, nebo pseudoviriony (PsVs) produkované v buňkách HEK 293, které obsahují virovou DNA. Dalším modelovým systémem použitelným pro studium HPV jsou lidské keratinocyty imortalizované virovou DNA, který imituje časnou fázi infekce viru.
Z dalších virů tým Laboratoře zkoumal nově objevený TT virus ve vztahu k postransfuzní hepatitidě neznámého původu. V epidemiologické studii jsme zjistili značnou promořenost populace tímto virem. Bylo prokázáno, že se tento virus přenáší krví, ale i například pohlavní cestou. Jeho etiologie v postransfuzní hepatitidě však prokázána nebyla. TT virová infekce je však u pacientů po alogenní transplantaci hematopoetických buněk výrazně častější a s vyšší virovou náloží než u zdravé populace. Kinetika virové nálože koresponduje s rekonstitucí imunitního systému pacientů.
V neposlední řadě se Laboratoř intenzivně zabývá studiem lidských polyomavirů a to především epidemiologií lidských polyomavirů HPyV6, HPyV7, TSPyV, HPyV9, MWPyV, KIPyV, MCPyV, které byly objeveny díky molekulárně–biologickým metodám v období 2007 až 2012. Kromě ELISA testu pro detekci protilátek pro všechny známé polyomaviry jsme zavedli testy pro kvantifikaci virové DNA. Tyto testy jsou použitelné v klinické praxi. V současnosti se dále zabýváme studiem MCPyV, který je etiologickým agens kožního nádoru karcinomu z Merkelových buněk. MCPyV je jediným doposud známým lidským polyomavirem, který se podílí na vzniku nádorů. Monoklonálně integrovaná a replikačně defektní forma virového genomu se vyskytuje až u 80-95 % karcinomů z Merkelových buněk, neuroendokrinního nádoru s nízkou incidencí. TSPyV vyvolává vzácné kožní onemocnění trichodysplasia spinulosa, role dalších polyomavirů v lidské patologii je zatím neznámá. Ve spolupráci s dr. Vojtěchem Šrollerem z Laboratoře virologie bychom rádi pokračovali v charakterizaci MCPyV v karcinomu z Merkelových buněk a životního cyklu viru. Specifické vlastnosti virového životního cyklu mají pravděpodobně zásadní význam pro patogenezi karcinomu z Merkelových buněk, a to zejména s ohledem na málo známé události, které vedou ke vzniku nádorů (místo produktivní replikace viru, infekce permisivních versus nepermisivních buněk, pořadí událostí při integraci, změny hostitelského genomu).
Ve skupině polyomavirů chceme dále více zkoumat BK virus. Plánovaná studie bude zaměřena na hledání typově specifické prevalence viru BK v rizikové populaci imunosuprimovaných a onkologických pacientů s cílem zjistit rizikovost reaktivace versus infekce novým typem viru k hemoragické cystitidě a nefropatii u těchto pacientů.