Laboratoř biochemie RNA
Vedoucí:
RNDr. Martin Pospíšek, Ph.D.
Katedra genetiky a mikrobiologie
Poradce pro studium magisterské specializace Molekulární biologie a genetika eukaryot
Viničná 5, 2NP, místnost 114
Kde nás najdete:
Budova Viničná 5, Praha 2 - Nové Město, 128 43
přízemí (místnost P10), suterén (místnosti S12, S14), 1. patro (místnosti 112, 114, 115)
Výzkumná problematika
Další informace lze nalézt i na adrese http://web.natur.cuni.cz/~pospisek
Laboratoř biochemie RNA se zabývá především studiem eukaryontní syntézy bílkovin a jejím vztahem k regulaci genové exprese. V našem výzkumu kombinujeme bioinformatický a experimentální přístup. Vytvořili jsme a spravujeme dvě veřejně přístupné databáze: http://iresite.org/ a http:/hcvivdb.org. V r. 2024 jsme se v rámci programů "Interakce mezi patogeny a hostiteli" a "Imunita proti virům a bakteriím" stali součástí i Národního institutu virologie a bakteriologie, což je platforma sdružující špičková vědecká pracoviště z celé ČR.
Náš experimentální zájem lze rozdělit do tří hlavních okruhů:
1) Na čepičce závislá iniciace translace – překvapivé funkce translačních iniciačních faktorů eIF4E.
Syntéza proteinů představuje pro buňku hlavní výdej energie, proto se nelze divit, že je tento proces velmi pozorně monitorován a hned ve svém počátku regulován. Buněčné mRNA nesou na svém 5´-konci tzv. čepičku (m7GTP). Ta je nezbytná pro rozeznání transkriptu translačním iniciačním faktorem 4E (eIF4E1), který pak zprostředkovává navázání na translační aparát buňky.
U vyšších eukaryot se vyvinuly paralogické geny kódující translační faktory rodiny 4E. Tyto bílkoviny, ačkoliv jsou velice podobné kanonickému faktoru eIF4E1 na sekvenční úrovni, získaly některé speciální vlastnosti, díky kterým např. regulují preferenční translaci některých mRNA, zprostředkovávají translační inhibici nebo je jejich exprese tkáňově, či vývojově specifická. V lidském genomu můžeme najít vyjma genu pro prototypický eIF4E1 ještě geny pro eIF4E2 (4EHP, II. třída proteinové rodiny) a eIF4E3 (3. třída).
Provedli jsme rovněž bioinformatickou analýzu genů rodiny 4E u člověka a zjistili jsme, že každý gen produkuje několik biologicky významných, sekvenčně rozdílných mRNA. Podrobně jsme zmapovali 3´-konce těchto transkriptů a experimentálně jsme potvrdili současné využívání několika polyadenylačních míst. Získali jsme cDNA vybraných variant a ty jsme posléze použili pro vytvoření N-terminálních fúzí s kódující sekvencí GFP. To nám dovolilo vytvořit stabilní tkáňové linie s inducibilní expresí konkrétní 4E bílkoviny označené zelenou značkou. Tento systém jsme využili pro popsání buněčné lokalizace jednotlivých proteinů 4E, kde jsme dospěli k velice překvapivému výsledku, a to, že každý ze studovaných proteinů vykazuje jedinečné lokalizační schéma ohledně jeho přítomnosti v P-bodies a stresových granulích. Tento výsledek též vypovídá o jedinečné a nezastupitelné funkci každého z těchto iniciačních faktorů v buňce. Naším současným zájmem je hledání dosud neznámých interakčních partnerů proteinů eIF4E2 a eIF4E3 a nalezení buněčných transkriptů, které jsou specificky vázány na tyto dva iniciační faktory. Okruh zájmu o faktory eIF4E1 a eIF4E2 završuje výzkum u brouka Tribolium castaneum a to hledáním vývojových defektů po umlčení příslušných genů.
2) Na čepičce nezávislá translace, IRES Viru hepatitidy typu C a pGKL plazmidy.
Některé virové a buněčné RNA se překládají nezávisle na čepičce tím způsobem, že se váží na ribozómy přímo, pomocí tzv. IRES elementů (Internal Ribosome Entry Sites). Proto se stal dalším objektem našeho zájmu Virus hepatitidy C (HCV). Schopnost produkovat virové proteiny je nezbytným předpokladem produktivní infekce, která je v tomto případě plně závislá na funkčním IRES elementu. Nalezení látek inhibujících funkci IRES by mohlo sloužit k zavedení skutečně účinné léčby této zatím neléčitelné nemoci. O vážných zdravotních problémech hovoří i Světová zdravotnická organizace, která infekci HCV označuje za tikající bombu, neboť tímto virem je celosvětově nakaženo okolo 200 miliónu lidí.
Náš zájem o IRES zprostředkovanou translaci se projevil ve vytvoření databáze IRESite (http://iresite.org/), která obsahuje dostupná data o experimentálně ověřených IRES sekvencích a strukturách a v současnosti je jedinou udržovanou databází tohoto druhu. Dále jsme se zaměřili i na metodické zpracování dostupných informací o vlivu změn primární sekvence IRES na jeho sekundární strukturu a funkčnost jeho jednotlivých domén. V souvislosti s tím jsme spustili databázi HCVIVdb (HCV IRES Variation Database; http:/hcvivdb.org). V minulých letech se podařilo zavést v laboratoři modelový systém, kde lze studovat IRES přímo v kvasinkových buňkách. Současně optimalizujeme použití bicistronického reportérového systému pro prohledávání knihoven biologicky aktivních látek s cílem najít translační inhibitor HCV IRES.
Dalším tématem naší laboratoře je posttrankripční a translační regulace transkriptů pocházejících z plazmidů pGKL. Plazmidy pGKL1 a 2 se přirozeně vyskytují v cytoplasmě kvasinky Kluyveromyces lactis. Patnáct anotovaných čtecích rámců kóduje experimentálně ověřené nebo domnělé složky transkripčního aparátu včetně některých enzymů zprostředkovávajících syntézu čepičky. V současnosti studujeme mechanizmus, jakým se vytvářejí 5´- a 3´-konce plazmidových transkriptů a jak probíhá jejich translace.
3) Studium protein-proteinových interakcí a jaderné funkce Interleukinu-1α pomocí kvasinkových a lidských tkáňových kultur.
Protizánětlivý Interleukin-1α (Il-1α) je klíčovým hráčem imunitních reakcí u vyšších eukaryot. Ačkoliv jeho působení na jednotlivé typy buněk je značně rozdílné, po dlouhém zkoumání se ukázalo, že je spojen s celou řadou autoimunitních a kardiovaskulárních onemocnění včetně revmatické artritidy nebo Alzheimerovy nemoci. Překvapivě značná část Il-1α se přesunuje do jádra, kde interaguje s histon-acetyltranferázovými komplexy. V naší minulé práci jsme pomocí imunoprecipitací a kvasinkových delečních kmenů určili vazebné místo pro prekurzor Il-1α v HAT/Core modulu kvasinkového komplexu SAGA. Současně jsme zjistili překvapivou strukturní podobnost mezi N-terminální doménou Il-1α a C-regulační doménou kvasinkové AMP-aktivované proteinkinázy Snf1, která interaguje s HAT komplexem. Toto zjištění je o to překvapující, že stejná interakce byla popsána i pro lidský homolog Snf1. Uvedené zjištění je pokračováním našeho dlouhodobého zájmu o cytokinovou signalizaci a související transkripční regulace.
Metodicky zaměřený výzkum a další aktivity
Při studiu na čepičce nezávislé translace jsme publikovali několik metodických článků. Popsali jsme kryptickou transkripci v hojně používaném reportérovém genu pro luciferázu, což v budoucnu pomůže odstranit některé metodické potíže při charakterizaci IRES. V roce 2005 jsme publikovali zjednodušený protokol pro elektroforézu RNA v agarózových gelech. Tento článek patří již několik let mezi nejstahovanější publikace časopisu Analytical Biochemistry a z tohoto důvodu byl odměněn nakladatelstvím Elsevier. Podíleli jsme se na zdokonalení metody polyzomálních profilů, což jsme popsali ve dvou přehledových článcích.
Tým laboratoře je aktivní i v organizaci vědeckého života. Pracovníci laboratoře v roce 2003 založili tradici každoročních RNA klubů, z nichž řadu přímo též organizovali, a které se staly pravidelným místem setkávání mnoha vědeckých pracovníků se zájmem o problematiku RNA.