S klasickým Sangerovým sekvenováním máme více než dvacetiletou zkušenost, ročně zpracováváme více než 25 tisíc vzorků. To nám umožňuje držet nízké ceny, ale přesto můžete očekávat individuální přístup – v případě potřeby řešíme chyby při přípravě vzorků a optimalizujeme reakce pro různé typy vzorků, včetně vzorků s problematickou sekvencí.
Pro sekvenování PCR produktů a plasmidů používáme 24-kapilárový genetický analyzátor 3500xL (Life Technologies). Výsledky odesíláme e-mailem ve formátu *.ab1 (chromatogram) a *.seq do jednoho až dvou pracovních dnů.
Vzorky dávejte do sběrné lednice ve Viničné 7 do krabice označené Sekvenace Biocev nebo do sběrné schránky u recepce v Biocevu.
Vyplňte Průvodku pro sekvenační reakci a analýzu nebo Průvodku pro analýzu hotových sekvenačních produktů a zašlete ji na adresu seqlab@natur.cuni.cz, v případě potíží s odesíláním na adresu hrda@natur.cuni.cz. Papírové průvodky nemusíte se vzorky posílat. Průvodka se částečně sama vyplňuje - pokud ne, stáhněte si ji znovu.
Soubor, předmět E-mailu a sáček se vzorky pojmenujte stejně zkratkou a datem ve tvaru JJPDDMMRR. Např. 6. 9. 2024 – Ford Harrison, bude označení HAF060924.
Jednotlivé zkumavky označujte zkratkou a pořadovým číslem z průvodky. Číslujte logicky.
Prosíme dodržujte: 1 vzorek = 1 zkumavka/jamka = 1 řádek v průvodce = 1 analýza.
Pokud sekvenujete poprvé, začněte s malým počtem vzorků. S menším počtem začínejte i nové série, např. po delší době nebo s novými primery.
Pokud máte další požadavky, např. spěcháte na výsledky, chcete výsledky na jinou adresu, požadujete speciální podmínky (vyšší/nižší teplotu nasedání, Hairpin protokol, problémy při předchozí sekvenaci podobného vzorku, použití BigDye® Terminator v1.1 apod.), zapište je jak do průvodky do kolonky Speciální požadavky, tak i do emailu.
Pokyny pro přípravu vzorků zde.
Přečišťování PCR produktů a plasmidů před sekvenační reakcí standardně neprovádíme (pouze po domluvě a pro malý počet vzorků, např. v případě pochybností o kvalitě čištění). Opakované analýzy na genetickém analyzátoru (pokud selže elektoforéza) provádíme zdarma. Samotnou sekvenační reakci nelze opakovat, dodané připravené vzorky stačí na jednu sekvenační reakci a při jejím selhání je nutno zaslat nové vzorky. Sekvenační reakce může selhat z těchto důvodů: nedostatečná čistota DNA, nedostatečná koncentrace vzorku nebo primeru, nesprávný primer, spíše výjimečně sekundární struktura DNA.
Pokud reakce neproběhla, něco je špatně! Neposílejte tytéž vzorky připravené stejným způsobem, nebude to lepší! Zkontrolujte na nanodropu čistotu DNA (hl. u PCR fragmentů). Zkontrolujte, zda máte správné primery (hl. u plasmidů). Pročtěte si naše doporučení zde. Konzultujte nastalou situaci s námi a zašlete zvlášť DNA a primery. Koncentraci a čistotu DNA ještě přeměříme a případně DNA přečistíme a sami sekvenační reakci namícháme. V případě, že lze očekávat přítomnost vlásenky, doporučeme sekvenaci z druhého směru, případně sekvenaci Hairpin protokolem, který označte do speciálních požadavků.
Pro sekvenační reakci momentálně používáme kit BriliantDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit. Ke kitu přidáváme Enhancing buffer (BDX64, MCLAB) a sekvenační pufr (Applied Biosystems). Standardní reakce běží 35 cyklů: 10 s /96 °C, 5 s /50 °C, 2,5 min /60 °C. Při Tm primeru větším než 55°C a menším než 48°C modifikujeme profil reakce.
Čistíme ethanolovou precipitací s acetátem sodným (3M). Vzorky jsou pro analýzu rozpuštěny v denaturujícím Hi-Di formamidu. Analýza probíhá na 50 cm kapilárách na polymeru POP-7 (Applied Biosystems). Optimálně získáváme 800 bází. Kapilární elektroforéza probíhá v prostředí pufru s EDTA.