Příprava vzorků

Příprava vzorků pro sekvenační reakci a analýzu:

Vzorky připravujte do 0,2 ml tenkostěnných mikrozkumavek, do stripů nebo do platíčka. K označení zkumavek použijte svou zkratku a pořadové číslo z průvodky, stripy je možné číslovat celé, ale vždy tak, aby byla jasná orientace od 1. - 8. vzorku. Platíčka stačí pojmenovat zkratkou jména a datem, ale dbejte na to, aby jamky byly dostatečně uzavřené – pozor na netěsnící folie. Pipetujte a číslujte po sloupcích!

Celkový objem pro jednosměrnou sekvenační reakci je 8 μl:

- primer - POUZE jeden v množství 5 pmol, doporučujeme brát 1 μl ze zásobního 5 uM roztoku primeru. Tm 50-55°C opt., Tm 45-72°C max., na Tm lišící se od optima vždy upozorněte v průvodce, stejně jako na použití degenerovaných primerů (jejich používání ale spíše nedoporučujeme), upravíme profil sekvenační reakce. Některé univerzální primery můžeme do reakce přidat, v tom případě připravte vzorek do objemu 7 μl.

- DNA v množství 5ng/100 pb u PCR produktů a 3ng/100 pb plasmidové DNA (započítává se celá délka plasmidu, odpovídá obvykle 100-200 ng do reakce, max. 300 ng u velkých plasmidů). Sekvenování malých fragmentů a velkých konstruktů (nad 12 0000 bp) předem konzultujte s laboratoří. Doporučené množství je orientační, kvalitní a čistou DNA je možné osekvenovat i z nepatrného množství, naopak příliš mnoho DNA může zablokovat sekvenační reakci. Pokud vám sekvenace chodí dobře, koncentraci samozřejmě neměňte!

Pro přípravu vzorků čištených pomocí ExoSap a vzorků izolovaných z gelu se podívejte sem.

- voda (kvalitní), případně TRIS, v žádném případě TE pufr - EDTA blokuje reakci!!

Cena jedné reakce s analýzou: pro UK - 87 Kč, pro ostatní akademická pracoviště - 98 Kč, pro soukromé subjekty - 100 Kč.

Příprava vzorků pro Hairpin protokol:

V případě, že sekvenační polymeráza odpadá na vlásence, doporučeme použít aditiva a Hairpin protokol. Připravte pak dvě zkumavky – zvlášť 2 ul primeru v množství 5 pmol a zvlášť 4 μl DNA o celkovém množství 150 ng.

Za tento protokol účtuje příplatek 20 Kč.

Příprava vzorků na Analýzu hotových přečištěných sekvenačních produktů:

Vzorky dodávejte v 0,2 nebo 0,5 ml zkumavkách, řádně vysušené. Zbytky ethanolu narušují analýzu sekvence. Dosušit lze v otevřené zkumavce za cca 5 min. při 50-60°C. Vzorky je vhodné dodávat v neprůhledném sáčku.

Cena jedné analýzy: pro UK - 33 Kč, pro ostatní akademická pracoviště - 39 Kč, pro soukromé subjekty - 40 Kč.