Metody přípravy biologických vzorků pro elektronovou mikroskopii aplikované LEM
Laboratoř elektronové mikroskopie (LEM) poskytuje možnosti aplikace celé řady metod a technik přípravy biologických vzorků pro elektronovou mikroskopii, následující přehled uvádí základní z nich; většina existuje v modifikacích určených pro konkrétní typ vzorku. Nabízíme proto konzultace, při kterých se stanoví, jak vzorek pro daný účel připravovat, dále uživatelům nabízíme i zdrojovou metodickou literaturu, chemikálie a přístrojové vybavení.
1. Příprava vzorků pro SEM
fixace 2,5 % GA v 0,1 M pufru (min. 4 hod.); vypírání v 0,1 M pufru (3x15min.); postfixace 2% OsO4 v 0,1 M pufru (2-4 hod.); vypírání v 0,1 M pufru (dest. vodě) (3x15 min.); u sklerotizovaných/chitinizovaných vzorků lze krok fixace resp. postfixace vynechat; odvodnění vzestupnou ethanolovou nebo acetonovou řadou (30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100% po 15min.); vzorky odvodněné ethanolovou řadou převést do amylacetátu nebo acetonu resp. do terciálního butanolu nebo (přes aceton) do hexamethyldisilazanu (HMDS) - amylacetát (aceton,terc. butanol) : ethanol (resp. HMDS : aceton) 1:2, 1:1, 2:1 objem.dílů (po 15 min.); 15 min. 100% amylacetát (aceton, terc. butanol, HMDS).
1.1 SUŠENÍ POMOCÍ KRITICKÉHO BODU CO2
promytí vzorků z amylacetátu nebo acetonu kapalným CO2 v přístroji CPD 030 (5-9 lázní po 30 min.; velké objekty přes noc); zahřátí vzorků v kapalném CO2 na jeho kritickou teplotu/tlak a jeho pozvolné vypuštění v plynném stavu z komory.
1.2 SUŠENÍ ODPAŘOVÁNÍM/SUBLIMACÍ
vzorky v terciálním butanolu nebo HMDS sušit pod vakuem (rotační pumpy).
2. Příprava vzorků pro TEM
2.1 EM HISTOLOGICKÉ TECHNIKY ZALOŽENÉ NA CHEMICKÉ FIXACI
fixace 2,5 % GA v 0,1 M pufru (min. 4 hod., 4°) (alternativně různé typy fixáží, pufrů a aditiv – konzultace v LEM); vypírání v 0,1 M pufru (3x15min.); postfixace 2% OsO4 v 0,1 M pufru (3-4 hod.); vypírání v 0,1 M pufru (dest. vodě) (3x15 min.); odvodnění vzestupnou ethanolovou nebo acetonovou řadou (30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100% po 15min.); vzorky odvodněné ethanolovou řadou převést do acetonu nebo propylenoxidu – aceton (propylenoxid) : ethanol 1:2, 1:1, 2:1 objem.dílů (po 15 min.); 100% neutrální aceton (propylenoxid) 15 min.; převedení do vhodného druhu pryskyřice (alternativní výběr, konzultace v LEM) – pryskyřice : aceton (propylenoxid) 1:2, 1:1, 2:1 objem.dílů (2 hod., 4-6 hod., 6-12 hod.); čistá pryskyřice I, II (2 x 12-24 hod.); zalití do forem resp. beamkapslí, polymerizace v termostatu (24-48 hod.); krájení polosilných a ultratenkých řezů na ultramikrotomu, barvení polosilných (toluidinová modř, Humphrey aj.), kontrastování ultratenkých octanem uranylu (2-3% vodný roztok, tma, 20min.-1 hod., ethanolová atmosféra) a citrátem olovnatým (roztok podle Reynoldse, 1963, 20 min., atmosféra bez CO2).
2.2 METODY NEGATIVNÍHO KONTRASTU TOTÁLNÍCH PREPARÁTŮ
na síťku pokrytou formvarovou nebo aktivovanou uhlíkovou blánou nakápneme suspenzi vzorku, adheze 2 min., odsátí kouskem filtračního papíru, fixace 2,5 % GA v 0,1 M pufru 2-5 min. (pro současné imunoznačení 3% PA + 0,1 %(0,5%) GA), opláchnutí několika kapkami dest. vody, kontrastování kapkou 2-3% vodného roztoku octanu uranylu nebo kyseliny fosfowolframové 2-3 min. (alternativně kontrastovat v komůrce parami jodu (krystalický jód) 5-10 sec.).
2.3 FS (AFS) – MRAZOVÁ SUBSTITUCE
rychlé zmrazení vzorku metodou vysokotlakého zamražování (na přístroji High Pressure Freezer Leica EM PACT2 (na kooperujícím pracovišti), transfer v tekutém dusíku do automatické kryosubstituční jednotky Leica EM AFS2, náhrada ledu ve vzorku za organické rozpouštědlo (např. aceton), které může obsahovat i fixační činidlo (např. 2% OsO4 v acetonu) (pozvolné vícekrokové zvyšování teploty až k -20°C, kdy začne učinkovat fixační činidlo); postupná nízkoteplotní náhrada rozpouštědla pryskyřicí (zvyšující se koncentrace pryskyřice v rozpouštědle), UV resp. tepelná polymerizace a dále analogicky kap. 2.1 (metody mrazové substituce existují v mnoha variantách pro různé typy vzorků resp. účely studia, lišících se v použitých chemikáliích i uspořádáním kroků).
2.4 EM IMUNOLOGICKÉ TECHNIKY
metody provádíme v kooperaci s uživatelem, po konzultaci a ověření účinnosti v systému svět. mikroskopie. Fixace: 3% PA + 0,1 % (0,5%) GA (1-3 hod.,4°) nebo AFS, dále analogicky kap. 2.1 s pryskyřicemi typu LRW, Lowicryl, apod.; ultratenké řezy na niklové síťce jsou před kontrastováním inkubovány s protilátkou označenou koloidním zlatem vybrané velikosti.
3. Doplňkové techniky
čištění resp. leptání povrchu vzorků pro SEM a jejich pokovování (Au, Pt, jiné kovy) v naprašovačce SCD 050; lepení různých typů vzorků (C páska, koloidní Ag, Tempfix kit); příprava formvarové blány - potahování sítěk; uhlíkování sítěk v napařovačce JEOL JEE-420 a aktivace uhlíkové blány Ar plazmou (SCD 050) resp. doutnavým výbojem; lámání, rovnovážné lámání a příprava skleněných nožů na knife makerech, krájení skleněným, diamantovým a oscilačním diamantovým nožem na ultramikrotomech aj.
Podrobnější informace na http://www.paru.cas.cz/lem/book/